转染实验技巧（如下信息全部由客户提供）
DNA体外转染试剂
如何准备转染所需的质粒DNA
转染效率受到诸多因素的影响，除了细胞、培养基和载体等影响因素外，另外一项非常重要的因素便是DNA的质量。为了比较不同厂家的转染效率，我们分别从三家不同的供应商购买了质粒制备试剂盒来制备pEGFP-N3质粒DNA，并通过不同的方法将制备的pEGFP-N3质粒转运至NIH-3T3细胞。
pEGFP-N3质粒分别通过Endofree Maxi Piasmid Kit(Qiagen),PerfectPrep Endofree Piasmid Maxi Kit(5 PRIME,inc)及NucleoBond DNA Maxi Kit(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG)制备，我们测定了230,260,280及320nm的吸光值检测DNA的质量。通过上述三种方法制备的DNA质量如下：MACHEREY-NAGEL＞5Prime＞Qiagen。
pEGFP-N3由PolyJetDNA转染试剂运至NIH-3T3细胞。转染效率的高低与DNA的质量相符，由MACHEREY-NAGEL纯化DNA对应的转染效率最高，而由Qiagen纯化DNA对应的转染效率最低。因此，MACHEREY-NAGEL GmbH & Co.KG的质粒制备试剂盒被认为是制备转染级别DNA的最佳选择。
表皮细胞的转染
表皮细胞广泛遍布于身体，正常的表皮细胞较难转染，尤其是使用基于脂质体技术的转染试剂。我们使用电转(Amaxa)方法转染正常人的结肠表皮细胞并得到了65%的GFP标记细胞。非常感谢SignaGen,现在我们使用GenJet Ver II可以成功转染正常人的结肠表皮细胞并且转染效率显著提高至75%。
如下是使用GenJet Ver II(Cat#SL100489)转染表皮细胞的简单步骤：
1、转染时确保表皮细胞达到85%的融合度，并且保证细胞新鲜、健康。
2、对于6孔板，用不含血清的DMEM分别稀释1.0μg,DNA及3.0μl,GenJet Ver.II（Cat＝SL100489）.将稀释好的转染试剂加入DNA中，室温下放置15分钟以形成转染复合物。
3、将转染复合物直接加入表层细胞中：6孔板，每孔含1.0ml培养基，在血清/抗生素存在下，转染进行。
4、在转染进行5小时后，清除转染复合物并换成正常生长培养基。
5、转染后的24-48小时，检测转染基因的表达情况。
针对特定细胞选择更有效的实验步骤
GenJet Ver.II，LipoD293及PolyJet针对哺乳动物细胞的DNA体外转染试剂，均为您提供两种不同的转染步骤——一般步骤及高级步骤，这两种步骤分别针对不同的哺乳动物细胞。高级步骤主要针对难转的哺乳动物细胞，例如：MDCK，MDA-MB231，Caco-2等细胞。使用一般的转染步骤若是转染效率低于5%，那么使用高级转染步骤则可以将转染效率提升至60%。
如何选择转染步骤则取决于您的细胞特性。对于诸如HEK293，Hela，CHO，3T3，COS，HepG2，LNCaP，PC3，PC12，U2-OS，L929，MCF-7及Huh-7等常用细胞，一般的实验步骤就能得到满意的转染结果。对于诸如MDCK，MDA-MB231，Caco-2，SaoS-2及HUVEC等难转细胞，可以选用高级转染步骤。针对您的细胞，若是您尚不明确选择哪种转染步骤，我们建议您可先尝试一般步骤，如果您使用一般步骤得到的转染效率低于5%，那么您的细胞比较难转，您可尝试高级转染步骤。
转染L929细胞的简单步骤
L929是小鼠成纤维细胞瘤细胞株，经常被用来检测TNF-alpha及TNF-beta。对TNF的处理经常会引发细胞凋亡及死亡，因此L929细胞经常被用作免疫分析。但是，转染L929细胞非常难，尤其使用基于脂质体技术的转染试剂。我们使用GenJet VerⅡ及PolyJet转染L929细胞获得了75%的转染效率，简单的实验步骤如下：
1、转染时确保L929细胞达到80%的融合度，细胞必须健康并且传代不能超过9代。
2、对于6孔板，用不含血清的DMEM分别稀释1.0μg，DNA及3.0μl，GenJet VerⅡ或PolyJet转染试剂。将稀释好的转染试剂加入DNA中，室温下放置15分钟以形成转染复合物。其他规格的细胞培养器皿，可以根据表面积适当调整DNA含量。
如何优化PolyJet转染试剂
我们使用PolyJet DNA转染试剂转染表皮细胞及Raw267.4细胞非常有效，并且毒性很小。对于如何更好的优化PolyJet转染试剂，我乐意分享以下几点：
1、DNA的质与量。DNA的纯度对于转染实验至关重要。由E Coli制备的DNA，A260/280必须达到1.80甚至更高。对于6孔板，通常每孔~1.0μg DNA足矣。其他规格的细胞培养皿，可以根据表面积适当调整DNA含量。
2、PolyJet/DNA的比率。对于表皮及Raw267.4细胞的转染，我们将PolyJet/DNA的比率固定在3:1，并且得到了满意的结果，没有为寻找更合适的比率问题而烦恼。
3、稀释。DNA及PolyJet的稀释一定不要含有血清。我们使用的是不含血清的高糖DMEM培养基，效果很好。请不要选择Opti-MEM，因为它可以影响转染复合物的形成，因此，千万不要使用Opti-MEM来稀释质粒及PolyJet。
4、转染中可以含有血清。我们在含有血清/抗生素及不含二者的情况下分别进行可转染实验，没有发现两种情况下转染效率有什么差别。因此，血清/抗生素对PolyJet转染试剂没有什么影响。
如何优化LipoD293转染试剂
LipoD293DNA转染试剂是脂质体DNA转运工具的升级版本。我们实验室使用LipoD293DNA转染试剂成功转染了HepG2，LNCaP，CHO及HEK293细胞。
接下来，我们乐意就如何提高转染效率，降低毒性等方面的小技巧同大家分享。
1、LipoD293/DNA的比率。尽管合适的比率由细胞类型决定，但是使用LipoD293/DNA，3:1的固定比率通常能得到很好的转染效率。
2、每孔中DNA的含量。对于24孔板来说，我每孔使用的0.2到0.5μgDNA。太多的DNA（例如每孔1.0μg）没有必要，并且会产生较高的毒性。其他规格的细胞培养器皿，可以根据表面积适当调整DNA含量。
3、DNA及LipoD293的稀释。一定不要使用含有血清的培养基来稀释二者。高糖的Plain DMEM培养基是不错的选择，但是，高糖并不是很重要。千万不要使用Opti-MEM（invitrogen生产）！Opti-MEM可以影响转染复合物的形成。我的同事没有认识到该点的重要性，错误地使用了Opti-MEM，导致转染效率低下。
4、血清/抗生素的存在与否对转染没有影响。目前，我们正在使用的哺乳动物细胞通常是用LipoD293进行转染的，血清/抗清素对于转染效率没有影响。与其他依赖于脂质体的转染试剂不同，LipoD293不受血清/抗生素的影响，因此您不必担忧转染中含血清培养造成的高细胞死亡率问题。
5、转染后更换培养基，对于我们正在研究的哺乳动物细胞，通常，我们是在转染后24小时更换培养基，没有必要在转染后5小时更换培养基。
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