标题：[讨论]构建遗传连锁图谱的分子标记

一）  基于DNA-DNA杂交为基础的DNA标记

这类标记是利用限制性内切酶酶切不同生物体的DNA分子后，用同位素或非同位素标记的随机基因组克隆或cDNA等作为探针，进行DNA间杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism )，即限制性片段长度多态性，由Grodzicxe:于1974年创立(Botstein et al.;1980 )。这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区段发生突变引起的。其原理是:在生物体基因组DNA上通常存在大量的限制性内切酶酶切位点，限制性内切酶可以在识别位点处切开DNA从而将很长的DNA分子酶解成许多长短不一的小片段，片段的数目和长度可以反映DNA分子上限制性酶切位点的分布。因此特定的DNA/限制性内切酶组合所产生的片段是特异的，它可以作为某一DNA的特有“指纹”。如果某一个限制性位点发生了改变，这个限制性酶切位点将不再识别这个位点，不再进行酶切反应，产生片段的大小将由最邻近的限制性酶切位点来决定。

二） PCR技术为基础的分子标记

1985年Saiki等发明了PCR技术，该技术采用一对3‘端相向的寡核昔酸作为引物，与模板DNA的互补序列进行识别和退火;然后在DNA聚合酶的作用下，通过在引物3‘端添加核昔酸实现对变性摸板单链的复制((Saiki et al,  1985)。典型的PCR反应通常进行25~50个循环，每个循环分3步，即摸板变性、引物退火和DNA合成。经过一个循环，目标DNA片段即被复制一次，随着循环次数的增加，DNA扩增产物呈指数增加。

1） 随机引物PCR标记

该类标记引物采用的是随机核昔酸序列，扩增事先未知的特异DNA片段，因此利用它们可在基因组中寻找未知的多态性座位作为新的DNA标记。

 RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA)，即随机扩增多态性DNA

 RAPD标记采用长度为10个碱基随机排列的寡聚脱氧核苷酸做引物和较低的退火温度(一般为36^39℃ )，在保证短核苷酸链引物与模板的稳定配对的同时，通过适当的错配，对基因组不同位点进行PCR扩增。由于不同DNA区段上可与引物同源互补的位点不同，扩增产物的数量和大小也不同，因而表现出多态性。

 ISSR(Inter-Simple Sequence Repeats)，即简单序列重复间区

利用RAPD技术的优点和基因组中丰富的SSR序列信息，检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性。引物长度一般为20个核苷酸，对两个相距较近，方向相反的重复序列之间的DNA片段进行扩增。由于基因组在这些扩增区域与引物结合的数量和位置的改变，使PCR扩增片段数量和长度改变，从而检测出多态性。ISSR标记呈孟德尔式遗传，具显性或共显性特点。

2）特异引物PCR标记

 SSR(Simple Sequence Repeat)，即简单序列重复，也称微卫星(MicrosatelliteRepeats)DNA，是由Rafalshi和Fourney于1993年提出的。在高等生物的基因组DNA上存在许多高度重复序列，它们的基本重复单元一般由2~4个核苷酸组成，如(GA)n, (AC) n或(GAA) n(其中n为重复次数，一般为10~50 )等。由于基本单元重复次数的不同，而形成SSR座位的多态性。

STS(Sequence-Tagged Site)，即序列标签位点(Olson et al., 1989)。该标记根据单拷贝的DNA片段两端序列，设计一对特异引物，扩增基因组DNA而产生一段长度为200~500 bp的特异序列。此标记可由RFLP标记转化而来。由于STS在基因组中只出现一次，从而可界定基因组特异位点，而且STS标记呈共显性遗传，分析结果稳定可靠，STS可通过PCR或杂交途径来完成物理作图。

三） PCR与限制性酶切技术相结合的DNA标记

这类DNA标记可分为两种类型，一种是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段长度的多态性，如AFLP标记。另一种是通过对PCR扩增片段的限制性酶切来揭示被扩增区段的多态性，如CAPS标记。

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)，扩增片段长度多态性。AFLP是1993由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种酶切后进行PCR选择性扩增的DNA标记技术。该技术采用双链人工合成接头(artificial adapter)连接于限制性酶切片段，然后利用5‘端与接头和酶切位点序列互补的引物进行PCR扩增。由于潜在的扩增产物可能达数百条，为减少扩增产物数目，可在引物3‘端增加1~3个选择性碱基，即引物二接头+酶切位点+1~3个核昔酸，PCR扩增产物经变性聚丙烯酞氨电泳分离，可分辨长度相差一个碱基对的片段。

 CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)，即切割的扩增产物多态性序列，是由Konieczny和Ausubel于1993年开发的一种DNA标记。该技术揭示的是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息，表现为限制性片段长度的多态性，所以呈共显性遗传。CAPS引物设计时所参考的序列信息来源于Genebank，基因组或cDNA克隆，或已克隆的RAPD标记。

四） 基于单核昔酸多态性的DNA标记

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)，即单核苷酸多态性标记(杜玮南等，2000)它是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等，它又被成为第三代多态性标记。SNP数量丰富，可自动化检测。