标题：2014年度方法:激光层照荧光显微技术

我们在进行荧光显微成像的时候，总要在信号强度和光漂白之间做出艰难的取舍，而高强度光照对活细胞和组织的影响也不容忽视。

激光层照荧光显微技术（Light-sheet fluorescence microscopy）能以很高的3D分辨率，长时间对生物学样本进行温和成像。这一技术结合高速相机，足以捕捉细胞或亚细胞水平发生的动态。日前，《Nature Methods》杂志将这个低光毒性的快速三维成像技术评为了2014年的年度技术。激光层照荧光显微技术的基本原理很简单，它不像宽场或共聚焦显微镜那样照射或扫描整个样本，而是用薄层光从侧边照射样本，然后从样本的上部或下部检测荧光，激发光路与检测光路垂直。激光层照荧光显微镜激发一个层面上的荧光基团，一次成像一个面，这种技术不仅大大降低了光毒性，还提高了长时间成像活样本的能力。

Light-sheet技术始于一百年前，原本是用来成像胶体的。后来，Ernst Stelzer等人用这一技术成像了荧光标记的活斑马鱼胚胎，Light-sheet技术由此重新焕发了活力。Stelzer在本期Nature Methods杂志上撰文，介绍了这一技术的起源、原理和应用潜力。激光层照荧光显微技术的崛起，离不开荧光蛋白和转基因标记的发展。实际上，只有物理学、生物学等多个领域进行跨学科合作，人们才能充分挖掘出这一技术的潜力。随着商业化仪器的不断推出和升级，相信激光层照技术将为我们揭示以往难以想象的生物学细节。

目前的激光层照荧光显微镜可以实现多角度成像（multiview），并与超高分辨率成像、双光子激发和结构照明结合起来。这一技术能够快速对活细胞进行3D成像，在透明的固定样本中获得惊人的静态图像。举例来说，人们已经用激光层照荧光显微镜成像了活体心脏和运作中的大脑，跟踪了胚胎发育时的细胞迁移。激光层照荧光显微技术在神经生物学中的应用特别令人期待。因为这一技术能够同时成像大脑中的大量细胞，有望为我们揭示这一神秘器官的整体属性。Misha Ahrens等人在本期的Nature Methods杂志上发表文章探讨了这个问题。激光层照成像是一项充满挑战性的工作，激光层照实验会生成海量的数据，我们需要找到更好的方法处理和分析这些数据。此外，激光层照成像的样本制备也和成熟的样本制备方案完全不同。

值得注意的是，最佳效果的激光层照成像仍然需要较小的透明样本。对于不那么透明的大样本而言，我们还需要想办法解决散射和相差问题。另外，我们在进行激光层照成像时，依然需要监控潜在的光毒性，虽然激光层照技术的光毒性比较小，但并不等于完全没有光毒性。

原文检索：

Method of the Year 2014