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Genome Sequencer 20 系统一经推出，就受到了国际上基因组学专家的广泛关注，并在世界各大测序实验室相继成功落户。可以说，随着Genome Sequencer 20系统的不断推广应用和升级，快速基因组测序的时代已经来临，并对整个基因组学的研究将产生巨大的推动作用。 GS20高通量测序技术原理 GS20高通量测序技术是一种新的依靠生物发光进行DNA序列分析的技术,在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的，此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳，具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点，在遗传多态性分析、重要微生物的鉴定与分型研究，克隆检测和等位基因频率分析等方面具有广泛的应用。 GS 20 高通量测序技术操作流程 1.剪切、连接 GS 20 高通量测序的方法不需要进行繁琐的建库的过程，而是利用高压氮气将基因组DNA“剪切”成300－800个碱基的片断。然后利用核酸内切酶、聚合酶和激酶的作用在DNA片断的5’端加上磷酸基团，3’端变成平端，然后和两个44个碱基长的衔接子（adaptor）A、B进行平端连接。A、B 衔接子各自含有20个碱基的PCR 引物序列、20个碱基的测序引物序列和4个碱基的对照序列（TACG），除此之外，B衔接子的5’端还标记有一个生物素基团，供后续的分离合适的测序模板使用。 2.单链DNA模板的分离 在连接反应的过程中，由于是平端连接，因此连接后的产物含有“缺口”，需要对其进行“缺口修复”。 在分离步骤中，GS 20高通量的测序方法选用了包被有链霉亲合素的磁珠，由于生物素可以与链霉亲合素特异结合， 加入特异性的Melt洗脱溶液，温度提高到DNA的熔解温度以上，就可以选择性的将单链的AB连接产物洗脱下来，得到后续PCR扩增和测序所使用的DNA模板。如图2。 3.emPCR （emulsion PCR） 在得到仅含有A、B衔接子单链DNA模板以后，此DNA模板和过量的DNA 捕捉珠子退火结合，并被吸附到一种用于PCR反应的油-水混合物的小滴上，此油-水混合物的小滴包含了PCR反应所必须的各种试剂，因此在合适的条件下，以单链的DNA为模板进行PCR扩增，结果得到大量同一序列的DNA链。最后，打断PCR反应过程，对结合有大量DNA链的珠子进行富集，供下一步的反应使用。如图3。 4.测序反应 GS 20 高通量测序技术在进行测序反应时，使用了一种叫做“PicoTiterPlate”的设备。整个反应体系是皮升级别的：一片平板上面有大约160万个孔；每平方毫米面积内有480个孔，大约每个孔的体积是75皮升，平均直径为44um，只含有一个上述结合有大量DNA链的珠子。一块平板可以得到20万个测序读长，每个测序读长平均在100个碱基左右，因此，一块PicoTiterPlate 的测序读长最终可以达到2,000万个碱基。 Sanger 测序方法和GS 20 高通量测序方法的比较 以对一个200万碱基的基因组测序为例，两种测序方法的比较如下： 从上述比较可以看出，GS 20 高通量测序技术具有如下方面的优势： 1. 快速：在一个4.5小时的测序反应中，可以读出2,000万个碱基 2.成本低廉：所需的每个碱基的测序成本是Sanger测序方法的几十分之一左右 3.方法简便，高效：不需要进行建库、克隆挑取、质粒提取等工作，一个人可以在几天内完成一个微生物物种的测序工作 4.简单、方便：仪器易于操作，提供完整的解决方案 GS 20高通量测序技术的应用 自从2005年年底GS 20 高通量测序仪器问世以来，已经相继在世界上各大测序实验室成功落户。目前也已经有相应的高质量的文献发表在国际顶级的科学期刊上（具体可查询https://www.roche-applied-science.com/sis/sequencing/genome/index.jsp）,如《Nature》，《Science》。 它的主要应用领域表现在： 1. 扩增产物测序 2.寻找基因组中的Sanger方法不能发现的稀有突变 3.可应用于进行开放阅读框（ORF）的鉴定，不同生物间的同源性分析，基因组结构概况分析 4.鉴定不同菌株的保守区域，突变热点和基因插入或者缺失，了解药物抗性的遗传基础 5.识别微生物产生的药物前体有关的基因或者途径，比较致病性和非致病性微生物的区别作为发展抗微生物药物的遗传学基础 6. 病毒，microRNA、SAGE文库、cDNA文库和BAC文库的测序
来源：生物技术世界
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