标题：酵母系统表达与纯化制备

商品名称：酵母系统表达与纯化制备

商品说明：

酵母系统表达与纯化制备

步骤1. 目标基因全基因合成
时间：2周
步骤2. 目标基因亚克隆
时间：1周
步骤3. P. Pichia表达菌株电转化：
            酶切线性化表达质粒
            将表达质粒通过电转化到高效的P. Pichia表达菌株中
            通过PCR鉴定至少挑选5个阳性克隆
            可提供表达菌株：X33，GS115，KM71和SMD1168
时间：1周
步骤4. P. Pichia表达菌株筛选：
            将5个阳性克隆于BMGY培养基中扩增，然后换至BMMY培养基中，并加入甲醇诱导表达目标蛋白。
            SDS-PAGE电泳检测培养上清中目标蛋白的表达情况，并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达。
            如果培养上清中检测不到表达，则通过将上清浓缩20倍作用再检测，或通过Western-blot方法检测目标蛋白表达
时间：2周
步骤5. P. Pichia表达菌株表达优化：
            挑选20个阳性克隆进行常规表达筛选，并对其中表达最好菌株优化表达条件。
            对挑选出来的单克隆菌株，优化培养及诱导条件（培养基，菌体密度，甲醇浓度，诱导时间等），提高目标蛋白的表达量。
时间：2周
步骤6. 目标蛋白表达及纯化：
            摇瓶培养1L重组酵母菌，诱导表达目标蛋白。
            通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
            通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。
            通过Western-blot验证目标蛋白正确性。
时间：2~3周
步骤7. 目标蛋白的再加工及详细检测
            对生物学活性要求较高的纯化后蛋白产品进行复性研究。
            内毒素去除，除菌，冻干等进一步加工。
            通过HPLC，质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。
时间：1~2周
步骤8. 大规模制备

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