标题：[推荐]H5N1亚型禽流感病毒ELISA检测试剂盒

 禽流感是禽流行性感冒（Avian Influenza）的简称，又称真性鸡瘟（fowl.plague），它是由正粘病毒科、流感病毒属、A型禽流感病毒（AIV）引起的禽类烈性传染病，被国际兽医局（OIE）定为A类传染病［1］。该病不仅给全世界的养禽业带来巨大的经济损失。也发生多次感染人的病例，特别是在2003年末又一次侵袭东南亚国家，造成大批人死亡。成为继SARS之后又一个严重威胁人类的病毒。我国是一个养禽大国，同时也是一人口密集的国家，因此对于严格控制禽流感的发生、准确诊断该病毒的研究具有重要的意义［2］。禽流感病毒抗体传统的诊断方法是ELISA、HI、AGP，但后两种方法敏感性较低。ELISA检测方法操作简便、具有灵敏度高、实际可操作性强等优点，目前国内中国农业科学院哈尔滨兽医研究所建立了检测禽流感的rNP－ELISA与全病毒间接ELISA（AIV－ELISA）诊断技术。国外已报道有检测禽流感抗体的试剂盒，但目前国内还没有AIV检测相关试剂盒的报道［3］。应用时购买渠道较窄。因此，我们在进行H5N1亚型禽流感感染小鼠模型研究之际，以H5N1型禽流感病毒为抗原，研制了特异的禽流感ELISA检测试剂盒。现将结果报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  毒株  (1)禽流感病毒H5N1型（由华南农业大学惠赠并经中国农科院哈尔滨兽医研究所鉴定）。(2)SPF鸡胚：9～12日龄鸡胚。(3)辣根酶标记山羊抗小鼠IgG-HRP，购自北京中山公司。底物为OPD。

    1.2  抗原的制备  根据参考文献［4］特异性抗原的制备：稀释病毒HA效价至23，0.2ml/只接种鸡胚尿囊腔。置于37℃，相对湿度为45％～60%的温箱内孵育。取24h以上死亡或48h以上没有死亡的鸡胚置4℃冰箱过夜，然后收集尿囊液。将收集的尿囊液以4000转/min低速离心5min，取上清液，测定禽流感病毒HA效价为：29。使用前70℃10min灭活病毒［3］。非特异性抗原的制备：收集经检测未感染有AIV的SPF级鸡胚尿囊液，4000转/min低速离心5min，取上清液作为非特异性抗原。

    1.3  对照血清的制备

    1.3.1  阳性血清对照  根据参考文献［5］的方法，抗原灭活后，接种SPF级ICR小鼠，制备高免血清。具体方法：

　　第一次免疫：每只小鼠取100μg抗原与等体积完全福氏佐剂充分乳化后，腹腔免疫。

　　第二次免疫：2周后，每只小鼠取100μg抗原与等体积不完全福氏佐剂充分乳化后，腹腔注射，加强免疫。

　　第三次免疫：2周后，每只小鼠取200μg抗原腹腔注射再次加强免疫。

　　1周后眼球采血，2000r/min离心5min，收集经HI试验检测禽流感病毒抗体为阳性的小鼠血清。最终HI效价为：8log2。-20℃保存作为阳性血清对照备用。

    1.3.2  阴性血清对照  眼球采血SPF级ICR小鼠。2000r/min离心5min，收集经HI试验检测禽流感病毒抗体为阴性的小鼠血清。-20℃保存作为阴性血清对照备用。

    1.4   ELISA工作流程以及相关的试剂配制  按照国标GB/T14926.50-2001中的方法进行配制和操作。

    1.5  方法的建立  根据参考文献［1，6，7］，抗原最佳工作浓度的确定：将辣根酶标记山羊抗小鼠IgG-HRP 1：4000稀释，将抗原分别做以下稀释1：2000、1：4000、1：6000、1：8000、1：10000、1：12000、1：14000、1：16000、1：18000、1：20000、1：22000、1：24000、1：26000。将阴性、阳性血清1：40（按照国标）；酶结合物最佳工作浓度的确定：辣根酶标记山羊抗小鼠IgG-HRP，分别做以下稀释1：2000、1：4000、1：6000、1：8000、1：10000、1：12000 ；将阴性、阳性血清最佳工作浓度的确定：稀释1：100、1：200、1：400、1：600、1：800、1：1000、1：1200；底物OPD在温箱内37℃避光显色10～15min。2mol/L H2SO4终止底物显色反应。在波长为490nm下测定其OD值。

    　　结果判定：固定其中一个条件不变，阳性血清与非特异性抗原反应OD值小于0.1，阴性血清与特异性抗原反应小于0.1，阳性血清与特异性抗原反应在1.0左右时，并且目测结果与OD值一致的最高稀释浓度为最佳工作浓度。

    1.6  特异性试验  选MHV、LCMV、Sendai 3种病毒抗体作为对照，与AIV阳性血清同时进行ELISA检测实验。以检测该试剂盒的特异性。

    1.7  敏感性试验  把阳性血清自200倍开始做连续稀释，按照ELISA工作流程进行试验，以看其P/N值。

    1.8  中间试验  按照已确定的最佳工作条件对选择的30份血清进行了检测。

    2  结果

    2.1  抗原最佳工作浓度的确定  由表1可以看出，本底值与抗原稀释度的大小无明显关系，但阳性值随着特异性抗原浓度稀释度的降低，OD值逐渐降低。当稀释达到1：20000时，阳性值为1.011，1：20000继续稀释浓度后OD值迅速下降。偏离标准OD值。同时P/N值也迅速下降。由于本底值很低，且受抗原包被浓度影响很小，同时阴性值也较低。因此确定抗原最佳工作浓度为1：20000的稀释度。表1  抗原最佳工作浓度的确定 注：A：阳性血清与特异性抗原反应OD值；B：阳性血清与非特异性抗原反应OD值；C：阴性血清与特异性抗原反应OD值；D：阴性血清与非特异性抗原反应OD值

    2.2  酶结合物最佳工作浓度的确定  抗原最佳工作浓度确定后，将辣根酶标记山羊抗小鼠IgG-HRP作为二抗，从表2中可以看出在酶浓度为1：10000时，OD值为1.126，并且在浓度稀释至1：10000以后，OD值迅速下降。因此，酶结合物最佳工作浓度确定为1：10000。 表２  酶结合物最佳工作浓度的确定

    2.3  阳性血清最佳工作浓度的确定  结果如表3。可以看出，阳性血清在1：1000时，OD值为1.112。并且在1：1000稀释以后的浓度，OD值迅速下降。而阴性血清不同稀释浓度对OD值影响很小。因此，阳性血清最佳工作浓度确定为1：1000。表３  阴性、阳性血清最佳工作浓度的确定

    2.4  特异性试验  选MHV、LCMV、Sendai阳性血清作为对照，与AIV阳性血清同时进行试验。结果如表4。可以看出该ELISA检测方法特异性较强。表4  特异性试验结果

    2.5  敏感性试验  由表5中可以看出，当血清稀释到1：10000时，所测OD值为0.317，P/N为3.202，仍可以判为阳性。从而证明本试验建立的方法，具有很好的敏感性。表5  敏感性试验结果注：A：阳性血清与特异性抗原反应OD值；B：阳性血清与非特异性抗原反应OD值；C：阴性血清与特异性抗原反应OD值；D：阴性血清与非特异性抗原反应OD值

    2.6  中间试验  应用本次实验建立的方法对实验样品30份血清进行了检测，其中HI试验所得的阳性样品应用本次所建立的方法进行复核，吻合率100%。本次试验结果如表6所示，可以看出本次试验建立的方法具有较好的敏感性。表6  中间试验结果

    3  讨论

    (1)ELISA方法是当今血清学检测中较为敏感而特异的检测手段之一。ELISA检测方法，在检测过程中简便、省时、省力。在结果判断过程中，比HI、AGP等方法更准确、客观，敏感性更高。本方法适合于基层临床禽类AIV感染状况，以及免疫后AIV抗体分泌情况的测定。同时，也为SPF鸡质量检测工作提供了有效的检测手段。

    (2)如何提高本试剂盒的敏感性和减少非特异性反应。首先是包被抗原以及浓度的选择，在本实验条件下，抗原选择SPF鸡胚尿囊液作为病毒扩增载体和非特异性对照，最佳工作浓度为1：20000，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG-HRP作为二抗，最佳工作浓度为1：10000。阳性血清最佳工作浓度为1：1000。

    (3)应用该工作条件选择MHV、LCMV、Sendai 3种病毒作为样本进行了检测，并与阳性AIV相比较。结果MHV、LCMV、Sendai 3种病毒都为阴性，AIV为阳性。表明该方法具有良好的特异性。最后，应用该方法对所选的30份血清样品进行了检测，并与HI试验检测结果进行了比较，结果ELISA阳性检出率为：58.33%，而HI阳性检出率为：41%。表明该方法具有良好的敏感性。

    目前国外试剂盒价格昂贵、并且购买途径较窄，本所H5N1亚型抗体检测ELISA方法的建立将解决基层应用中的这一难题，同时也更加方便于临床检验及科学实验方面的研究。

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