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同位素稀释结合固相萃取快速测定动物组织中β2
2007年03月22日
作者：吴平谷 应永飞 陈慧华 俞莎 徐小明 冯靓 沈向红 朱聪英
【关键词】 同位素稀释,固相萃取,,β2
摘要 本文采用同位素稀释结合固相萃取技术，测定动物组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺4种β2兴奋剂。动物组织加同位素内标D3沙丁胺醇和D9克伦特罗，经甲醇提取后，正己烷脱脂，过SLS离子交换固相萃取柱净化，用BSTFA+1%（φ）TMCS衍生，采用GC/MS 进行测定，内标法定量。实验表明，动物组织中添加2.0~10.0 μg/kg浓度水平的β2兴奋剂，方法回收率在72.5%~97.9%，相对标准偏差1.0%~11.4%，线性范围为12.5~500 μg/L，样品中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺最低检出限分别为0.5 μg/kg、 1.0 μg/kg、 0.5 μg/kg和1.0 μg/kg。
关键词 同位素稀释，固相萃取， β2兴奋剂，气质色谱法
1 引言
国家科技部“十五”国家重大科技专项食品安全关键技术要求检测10种以上β2兴奋剂。β2兴奋剂是苯乙醇胺类化合物，按照苯环上取代基不同分成苯胺型（如克伦特罗）、苯酚型，苯酚型又分邻苯二酚型、间苯二酚型（如特布他林、莱克多巴胺）和水杨酸型（如沙丁胺醇）。从市场监管情况看，克伦特罗的使用有所下降，沙丁胺醇、莱克多巴胺的使用以及与克伦特罗的混合使用有所增加。限制兽药残留检测关键在于样品前处理，目前很多测定β2兴奋剂的方法前处理过程繁琐[1～８]，且使用大量毒性高的有机溶剂，这不仅不利于分析人员的身体健康，同时大量排放有毒溶剂造成对环境的污染。因此，以简化样品前处理为目的的新的分析技术不断出现。这些技术的出现极大减少分析人员的工作量，缩短分析时间，并且减少了样品处理过程中所产生的大量有机废液对环境造成的污染。同位素稀释方法在微量组分准确定量分析方面有很大优势，广泛应用于微量、痕量组分如三氯丙醇、二英等[7、8]；固相萃取技术为近年发展起来的一种微量样品处理技术，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，能显著减少溶剂用量，简化了样品预处理过程[1、3、5]。本研究采用GC/MS法，将固相萃取和同位素内标定量相结合，测定动物组织中游离的特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺4种常见且有代表性的β2兴奋剂，从而建立动物组织中β2兴奋剂多残留检测技术平台。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂6890 GC5973MS色质联用仪（美国Agilent 公司）；超声清洗器；旋涡混匀器。特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇（北京康农兴牧科技发展中心）；莱克多巴胺标准品（北京康农兴牧科技发展中心,纯度大于98%）；甲醇、盐酸、乙酸乙酯、氨水、无水硫酸钠等均为分析纯（J&K Chemical公司）；双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）+1%（）三甲基氯硅烷（TMCS）(北京康农兴牧科技发展中心); C18、SCX、WCX、SLS、SLC固相萃取柱规格为500 μg/6 mＬ(北京康农兴牧科技发展中心)；MCX固相萃取柱规格为100 mg/6 mＬ(北京康农兴牧科技发展中心)。
2.2 标准溶液制备β2兴奋剂标准储备溶液（1.0 g/Ｌ）：分别称取4种β2兴奋剂10 mg于10 mＬ容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，存放在冰箱中备用,标准使用液用甲醇稀释至0.1 mg/L。D3沙丁胺醇、D9克伦特罗（100 mg/L）储备液：加拿大Palaloger博士惠赠，使用时用甲醇稀释至10 mg/L混合液。
2.3 样品处理称取2.0 g经绞碎均匀的样品于15 mL具塞离心管中，加40 μL 1.0 mg/L D3沙丁胺醇、D9克伦特罗混合液，静置10 min，然后加入10 mL甲醇，在超声清洗器中提取20 min，每隔5 min振荡一次，4000 r/min离心10 min，分出上清液，在50℃下氮气吹至5 mL,加5 mL正己烷脱脂后氮气吹至1.5 mL左右,用1.0 mol/L HCl调节pH至2.0, 4000 r/min离心10 min后上清液进行净化。将上清液加到已用甲醇、水和４０ mmol/L HCl活化的SLS净化柱上,然后用水、甲醇淋洗除杂，最后用10 mL 4%氨化乙酸乙酯（V／V）洗脱，洗脱液在水浴中氮气吹干。
2.4 样品衍生化在洗脱液全部蒸发的残渣中加入0.1 mＬ BSTFA+1%（φ）TMCS，加盖瓶于旋涡混合器上震荡，在80℃的烘箱中加热1.0 h，氮气吹干，加0.2 mL甲苯溶解。取0.1 mg/L β2兴奋剂标准使用液25、50、100、250、500和1000 μＬ，分别加40 μＬ 1.0 mg/L D3沙丁胺醇、D9克伦特罗混合液氮气吹干，同时进行衍生化。取1.0 μL甲苯溶液进行GCMS分析。
2.5 色质谱条件HP5 MS 5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30 m×025 mm×025 μm)；进样口温度280℃：柱温120℃（3 min）10℃／min280℃（5 min）； 载气为高纯氦气（99.999%），流速0.9 mL/min，不分流进样。EI离子源温度230℃； 电子能量70 eV； 接口温度280℃； 电子倍增器电压1506 V ； 质量扫描范围30～550 amu；溶剂延迟：11 min 。
3 结果与讨论
3.1 色质谱分析条件的选择本研究以D3沙丁胺醇、D9克伦特罗为内标，采用硅烷化衍生测定特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，实验中比较了（1）30 m×0.25 mm×025 μm HP1MS柱；（2）30 m×0.25 mm，0.25 μm HP5MS柱；（3）30 m×0.25 mm， 0.25 μm HP1701柱。按照不同色谱柱进行色谱条件优化，然后对色谱图进行比较，发现柱（1）有拖尾现象，柱（3）基线漂移比较严重，柱（2）峰形以及分离度均较好，因此选择了30 m×0.25 mm×0.25 μm HP5MS柱。4种β2兴奋剂标准以及2种同位素内标标准品硅烷化衍生后总离子流图见图1。由图1可知，克伦特罗与D9克伦特罗可以完全分开，而沙丁胺醇与D3沙丁胺醇则不能分离，可以通过选择离子进行定性定量分析。
图1 标准品硅烷化衍生后总离子流(略)
Fig.1 Total ion current chromatogram of standards by GC/MS
1.特布他林（terbutaline)；2. D9克伦特罗(D9clenbuterol); 3.克伦特罗(clenbuterol); 4+5. D3沙丁胺醇+沙丁胺醇(D3salbutamol+salbutamol); 6.莱克多巴胺(ractopamine).
3.2 质谱监测离子的确定按照欧盟对兽药残留确认检测要求，质谱法测定定性要求每个化合物至少选择4个监测离子，其中1个为定量离子，其它为定性离子。根据上述4种β2兴奋剂全扫描质谱图以及实际样品检测过程离子的干扰情况，确定监测离子列于表１。在实际样品检测中，如果样品总离子流图与标准具有相同的保留时间，且选择监测的离子相对强度（与定量离子的比例）与标准响应选择离子强度相一致，可以确定响应β2兴奋剂为阳性，然后采用内标法进行定量分析。
表1 硅烷化衍生后β2兴奋剂监测离子(略)
Table 1 Masses of diagnostic ions after EIionization of β2agoniststrimethylsilane (TMS) derivatives
采用上述选择离子监测方式,在12.5~500 μg/L浓度水平测定，制定YX标准曲线见表2。Y为各β2兴奋剂和对应内标峰面积之比，X为各β2兴奋剂和对应内标浓度之比。
表2 各化合物校正曲线、相关系数(略)
Table 2 Calibration curves， correlation coefficient of compounds
采用GCMS分析β2兴奋剂需要衍生，动物组织基质复杂，衍生后定量很不稳定，由表2可知，采用同位素内标定量测定，各化合物线性关系非常好，可以较好的克服衍生过程及进样造成的误差。
3.3 样品提取、净化条件的选择动物组织中β2兴奋剂测定普遍采用液固提取，调节溶液pH值后再进行液液萃取[1～3]。但是研究发现，不同β２兴奋剂最佳溶剂提取pH值不同[3]，本研究采用甲醇直接从动物组织中提取β2兴奋剂，既可以除去组织中蛋白质，又可通过甲醇提取物与正己烷分配除去组织中脂肪，再用氮吹除去甲醇，省略了液液萃取步骤。β2兴奋剂测定最常用的净化方法是固相萃取法［１～６］。用于β2兴奋剂净化的固相萃取柱有正相（硅胶、SLX）、反相（C8、C18）、阳离子交换柱（SCX、WCX、SLS、SLC）以及兼有吸附和离子交换作用的固相萃取柱（MCX）等。但对于本方法甲醇提取后水溶液，只能采用反相和离子交换柱。笔者[4]曾从除杂效果、过柱绝对回收率等方面比较以上不同净化柱对动物尿样的净化效果，采用各种离子交换固相萃取柱直接萃取动物组织中β2兴奋剂普遍比C18柱回收率高、效果好。由于动物组织甲醇提取物复杂，基体干扰较大，C18柱对大多有机物均有吸附，因而净化效果并不好。通过对各种离子交换固相萃取柱净化效果比较，SLS阳离子交换固相萃取净化柱比其它阳离子交换固相萃取柱效果好，4种β2兴奋剂回收率均较高，过柱回收率在85%以上；且SLS固相萃取净化柱为国产柱，价格相对便宜，因此选择SLS固相萃取净化柱作为β2兴奋剂多残留分析净化柱。
3.4 方法检出限、回收率及测量精密度对动物组织进行添加回收实验，各化合物添加浓度水平如表3所示，每个水平重复6次，实验结果见表3。由表3可知，4种β2兴奋剂在2.0、5.0和10.0 μg/kg各浓度水平，平均回收率72.5%～97.9%，相对标准偏差1.0%～11.4%,按照信噪比S/N=3：1计算β2兴奋剂类药物的检出限为0.5～1.0 μg/kg之间,方法各项指标较文献［１，２］都好。本方法空白样品的总离子流图和添加质量浓度5.0 μg/kg的β2兴奋剂样品的总离子流图分别见图2。
表3 4种β2兴奋剂方法检出限、回收率和精密度(略)
Table 3 Limit of detection (LOD), recovery and precision of four β2agonists
图2 肌肉空白(a)和添加浓度5.0 μg/kg β2兴奋剂肌肉(b)总离子流图(略)
Fig.2 Total ion current chromatograms of blank muscle (a) and the muscle spiked with 5.0 μg/kg β２agonists (b) by GC/MS
1. 特布他林(terbutaline)； 2. D9克伦特罗(D9clenbuterol); 3.克伦特罗(clenbuterol); 4+5. D3沙丁胺醇+沙丁胺醇(D3salbutamol+salbutamol); 6. 莱克多巴胺(ractopamine)。
图3 含克伦特罗和莱克多巴胺的肌肉总离子流图(略)
Fig.3 Total ion current chromatogram of muscle containing clenbuterol and ractopamine by GC/MS
峰号同图１（the peak numbers are the same as in Fig.1）。
3.5 样品分析采用本方法测定购于农贸市场的猪肉和猪肝脏，检出含克伦特罗和莱克多巴胺的猪肉1份，含量分别为147 μg/kg、 240.5 μg/kg，总离子流图见图3；含克伦特罗的肝脏1份，含量为24.8 μg/kg。目前，我国许多部门多采用酶联免疫法进行β2兴奋剂筛选，且仅测定克伦特罗或莱克多巴胺，但常用的β2兴奋剂有克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，GC/MS法测定β2兴奋剂是非常有效的确认方法。本方法采用同位素稀释结合固相萃取技术，建立4种β2兴奋剂的GC/MS测定方法，具有快速、杂质干扰少、灵敏度高等特点，其回收率、精密度均满足兽药残留分析要求。
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