大量质粒抽提纯化试剂盒
试剂盒组成及包装
5次
10次
20次
1.P1
30ml
60ml
120ml
2.P2
30ml
60ml
120ml
3.P3
30ml
60ml
120ml
4.W1
100ml
200ml
400ml
5.W2
100ml
200ml
400ml
6.EB
10ml
20ml
40ml
7、离心吸附柱
5个
10个
20个
8、废液收集管
5个
10个
20个
9、产品说明书
一份
一份
一份
二、实验准备：1.请按照标签指示在W2中加入无水乙醇，混匀，盖紧保存。
2.检查各溶液中是否有盐析出，若有，请于37℃-65℃温浴溶解。
三、实验操作步骤：
离心收集50-100ml新鲜菌液的菌体于50ml 离心管中，加入6ml P1，振荡至彻底悬浮。
加入6ml P2，迅速温和颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。（裂解时间不要超过5min）。
加入6ml P3，迅速温和颠倒离心管数次以充分中和，室温静置两分钟。10,000 g离心10min。
将离心吸附柱置于废液收集管中，转移上清液到离心吸附柱（尽量去除杂质）中，4000g 离心5min，弃滤液。
将离心吸附柱置回废液收集管中，加入20ml W1于离心吸附柱中， 4000g 离心5min,弃滤液。
将离心吸附柱置回废液收集管中，加入20ml W2（加入乙醇否？）于离心吸附柱中， 4000g 离心5min 弃滤液。以同样的方法再用20ml W2溶液洗涤一次；
将离心吸附柱置回废液收集管中，10,000g离心5min，以弃净W2。
小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的50ml 离心管中，在吸附膜中央加入1ml EB（Eluent Buffer）, 室温静置2-10min后，10,000g离心5min洗脱质粒。
取出离心吸附柱，将DNA溶液转移到一个无菌的1.5ml离心管中，置于-20℃保存备用。
四、补充说明：
1．严格控制菌体的起始量。菌体过量会造成得率低、超螺旋比率低等问题。如果所需的菌体比较多，请按照P1：P2：P3=1：1：1的比率适当加大溶液的用量。在实验过程中，下列现象指示菌体过量：
（1）加入P2混匀，2分钟后溶液仍然没有变成透明，或者溶液看起来虽然已经变成透明，但转动离心管时发现溶液太粘稠或者不均匀。
（2）加入P3后，不能完全混匀，有大块物形成。离心时很难使之离至管底。
推荐菌体起始用量：LB，高拷贝 50-250ml
LB，低拷贝 250-500ml
TB，高拷贝 50-100ml
TB，低拷贝 100-250ml
起始用量与菌体的浓度有关：菌体浓度高，起始量低一点；反之亦然。
2．如果在步骤4 “转移上清液到离心吸附柱（尽量去除杂质）中” 的操作中，吸入了絮状蛋白质，那么离心时絮状蛋白质将覆盖在吸附膜的表面，离心时难将液体离下。在加入EB液时，将发现EB液不能很快渗入吸附膜中，而是一直处在吸附膜表面。此时用一个干净的吸嘴轻轻在吸附膜的表面来回划几次可以使EB液进入吸附膜，这时可能出现两中情况：最终获得质粒DNA，但伴随着蛋白质的污染；仍然没有多少质粒DNA。