Trizol RNA分离方法
Trizol试剂是可即用的从动物、植物细胞和组织或微生物中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中，Trizol可溶解细胞内含物，同时具有使蛋白变性、抑制RNase活性的作用，保持RNA的完整性。可以从富含多糖、脂肪酸、蛋白质及RNase的样品中获得完整的RNA.
经过Trizol试剂处理后的裂解物，仅仅只需加入氯仿混匀，离心后，便分为三种液相：上层水相含有RNA，中层的半固体相含有DNA，下层的有机相含有少量的DNA和大量的蛋白质、多糖、脂肪酸和其它细胞碎片。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA, 一般所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值为1.6-1.8。
Trizol试剂可用于小量样品（50-100 mg组织、5×106细胞），也可用于大量样品（> 1 g组织或> 107细胞），对人、其它动物、植物和细菌组织都适用，整个操作步骤方便快捷，一个小时内即可完成反应，可同时处理大量不同样品。提取的总RNA没有DNA和蛋白的污染，可用于RT-PCR、 Northern Blot、核酸酶保护实验、mRNA分离和体外翻译等。
包装清单：Trizol 50ml或者100 ml 说明书 1 份
保存条件：2－8℃保存，本试剂自订购之日起一年内有效。
注意事项:
1. 所有离心管、枪头及相关溶液都必需无 RNA酶污染。耐高温器物可150℃烘烤4小时以除去RNA酶，其它器物除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌、烘干。溶液需用灭菌的DEPC水配制：加0.01%(体积比)DEPC至MiliQ级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水。
2.必需戴一次性手套操作，且尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA酶污染。
3.Trizol含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触Trizol，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。
4.需自备氯仿，异丙醇，75%乙醇（DEPC水配制），和DEPC水。
使用说明：
1. 细胞裂解或组织匀浆。
a. 贴壁细胞：吸尽培养液，按照每 10平方厘米细胞加入1ml Trizol，晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解，然后吸至离心管中。
b. 悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物或酵母细胞，或一千万细菌，加入1mlTrizol适当vortex，确保全部裂解。某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，或者用液氮研磨，确保全部裂解。
c. 组织：先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内，或者用液氮研磨组织样品。每50mg-80mg组织加入1ml Trizol，匀浆。
2. 室温静置5－15分钟。对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织，Trizol 裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物，需12,000×g， 4℃ 离心10 分钟，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中。
3. 按照每毫升Trizol加入0.2ml氯仿，vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。
5. 12,000×g， 4℃离心15分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，每毫升Trizol约可吸取0.5-0.55ml。
6. 按每毫升最初的Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。
7. 12,000×g 4℃离心10分钟，在管底可见胶状RNA沉淀，弃上清。
8. 每毫升最初的Trizol加入1ml 75%乙醇，vortex或颠倒混匀，
9. 7,500×g 4℃离心5分钟，弃上清。再用离心机甩一下（>5,000rpm, 离心1秒），小心吸尽液体。
10. 待RNA略干后，加入20微升DEPC水溶解，-70℃冻存。注意，切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/280值会低于1.6。
问题指南
低得率 ：A．样品裂解或匀浆处理不彻底；B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
A260/A280<1.65 ：A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高；B．样品匀浆时加的试剂量太少；C．匀浆后样品未在室温放置5分钟；D．水相中混有有机相；E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解 ：A．组织取出后没有马上处理或冷冻；B．样品或提取的RNA沉淀保存于-5－-20℃，未在-60－-70℃保存；C．细胞在胰酶处理时被破坏；D．溶液或离心管未经RNase去除处理；E．电泳时使用的甲酰氨pH低于3.5 。
DNA污染 ：A．样品匀浆时加的试剂体积太少；B．样品中含有组织溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。
蛋白和多糖污染：离心去上清后得到的RNA沉淀经以下操作应可去除这些污染： 在上一步中，每使用1ml Trizol，在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2 NaCl）。混合，离心，然后按照操作进行。这种方法可使蛋白多糖和多糖留在溶液中，而高效沉淀出纯RNA。从植物中提取RNA时，应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。
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